Hoe Vind Je De Beste Oplosbaarheidsoptie Voor Peptiden
Peptideoplosbaarheid. Het bepalen van het meest effectieve oplosmiddel om peptiden op te lossen is mogelijk één van de moeilijkste onderdelen bij het werken met peptiden en het uitvoeren van onderzoek. Waterige oplossingen — ook wel steriel water genoemd — zijn één manier om peptiden op te lossen. Toch kunnen er met deze methode nog steeds problemen ontstaan. Sommige problemen hebben betrekking op lage oplosbaarheid of zelfs volledige onoplosbaarheid. Dit komt vaker voor bij peptiden die lange hydrofobe aminozuursequenties bevatten. Ondanks deze uitdagingen kunnen onderzoekers tegenwoordig mogelijk de oplosbaarheid van een peptide voorspellen door de eigenschappen en aminozuursamenstelling ervan te bestuderen. Peptideoplosbaarheid
De fysische eigenschappen van de aminozuursequentie bepalen voornamelijk de oplosbaarheid van een peptide. Aminozuren kunnen worden ingedeeld in één van de volgende vier categorieën:
Basisch
Zuur
Polair ongeladen
Niet-polair (hydrofoob – lossen niet op in waterige oplossingen)
Onderzoekers suggereren dat: “De polaire aminozuren zijn: R, S (codons AGC en AGU), K, N, Q, H, W, C, Y, G, E, D; apolaire aminozuren zijn: T, M, I, P, L, S (codons UCN)”[1]. Een groot aantal niet-polaire of polair ongeladen aminozuren kan mogelijk beter oplossen met organische oplosmiddelen zoals:
DMSO
Propanol
Isopropanol
Methanol
DMF
Basische oplosmiddelen (ammoniumhydroxide) kunnen beter geschikt zijn voor peptiden met een hoog gehalte aan zure aminozuren. Het is belangrijk op te merken dat ammoniumhydroxide niet gebruikt moet worden bij peptiden die Cys bevatten. Zure oplosmiddelen, zoals azijnzuuroplossingen, kunnen beter gecombineerd worden met peptiden die een hoog aantal basische aminozuren bevatten.[2] Elk peptide lijkt gemakkelijker en effectiever op te lossen wanneer het met het juiste oplosmiddel wordt gecombineerd. De eerste stap waarmee rekening moet worden gehouden, is dat onderzoekers eerst moeten proberen peptiden op te lossen in steriel water. Dit is vooral belangrijk wanneer een peptide minder dan 5 aminozuren bevat, aangezien deze doorgaans gemakkelijker oplossen in water. Peptideoplosbaarheid
Belangrijke Stappen Voor Een Goede Oplosbaarheid Van Peptiden
Om de ideale oplosbaarheid te bereiken, moeten onderzoekers eerst een kleine hoeveelheid peptide testen in een oplosmiddel. Dit helpt om te bepalen of de oplossing geschikt is voor het peptide.
Laat het peptide eerst op kamertemperatuur komen voordat geprobeerd wordt het op te lossen.
*Gebruik oplossingen die verwijderd kunnen worden via lyofilisatie als steriel water niet werkt bij het oplossen van het peptide. Als geen van de opties succesvol blijkt, kan het oplosmiddel via lyofilisatie worden verwijderd, zodat het proces opnieuw gestart kan worden zonder het peptide te verliezen of te beschadigen.[3]Een licht verwarmde oplossing, bijvoorbeeld minder dan 40 graden Celsius, kan helpen bij de oplosbaarheid. Sonicatietechnieken kunnen eveneens nuttig zijn. Het is belangrijk te vermelden dat dit enkel helpt bij het oplossen van een peptide en de natuurlijke eigenschappen van het peptide niet verandert.
Onderzoekers moeten de aminozuursamenstelling van een peptide evalueren om de oplosbaarheidseigenschappen te voorspellen. Het is essentieel om het aantal en type ionische ladingen van een peptide te controleren, omdat dit helpt bepalen of het peptide zuur, basisch of neutraal is. Om dit te berekenen, wordt een waarde van -1 toegekend aan zure aminozuren (ook wel residuen genoemd), zoals Asp (D), Glu (E) en de C-terminale groep (COOH). Vervolgens wordt een waarde van +1 toegekend aan elk basisch aminozuur, waaronder Lys (K), Arg (R) en de N-terminale NH2-groep. Daarnaast krijgt elk His (H)-aminozuur bij pH6 een waarde van +1. Daarna wordt de netto lading van het peptide berekend door alle waarden op te tellen. Peptideoplosbaarheid
Wat Te Doen Wanneer Het Tijd Is Om Peptide-oplosbaarheid Uit Te Voeren
Pas wanneer de netto lading van het peptide is berekend, kunnen voorspellingen over oplosbaarheid worden gemaakt.[4] De wetenschappers melden dat “de pH van minimale oplosbaarheid varieert met de pI van het eiwit, maar dat de pH van maximale activiteit en maximale stabiliteit dat niet doen.” Hierdoor kunnen onderzoekers beginnen met het oplossen van peptiden in een geschikte oplossing. Zoals eerder vermeld, is het essentieel om peptiden eerst in steriel water op te lossen voordat andere oplossingen worden geprobeerd. Alleen wanneer water niet effectief blijkt, kunnen onderzoekers de volgende richtlijnen volgen.
Probeer eerst een peptide op te lossen in een azijnzuuroplossing (10–30%) wanneer de totale netto lading positief is. Als dit niet werkt, probeer dan TFA (<50μl). Wanneer het peptide negatief geladen is, kan geëxperimenteerd worden met ammoniumhydroxide (NH4OH; <50μl) om het peptide op te lossen. Let op: als Cys aanwezig is in het peptide, voeg dan een kleine hoeveelheid DMF toe en gebruik geen ammoniumhydroxide. Wanneer de totale netto lading 0 is, wat betekent dat het peptide neutraal is, zijn organische oplosmiddelen het meest effectief. Organische oplosmiddelen omvatten acetonitril, methanol of isopropanol. Gebruik een kleine hoeveelheid DMSO wanneer een peptide sterk hydrofoob is. Peptideoplosbaarheid
LET OP: DMSO kan peptiden die cysteïne, methionine of tryptofaan bevatten oxideren.[5] Sommige peptiden hebben ook de neiging om te aggregeren (gelvorming); voeg bij dergelijke peptiden 6 M guanidine•HCl of 8 M ureum toe. Peptideoplosbaarheid
Verdun de peptide-oplossing langzaam tot de gewenste concentratie door de peptide-oplossing geleidelijk toe te voegen aan een gebufferde oplossing, maar alleen wanneer het peptide volledig is opgelost. Het is cruciaal om zachte maar constante agitatie toe te passen tijdens het mengen om lokale concentraties van het peptide in een waterige oplossing te voorkomen. Het experimentele protocol suggereert ook om peptide-stockoplossingen te bereiden in hogere concentraties dan normaal vereist. Dit kan helpen om de stockoplossing later verder te verdunnen met behulp van assaybuffers. Peptideoplosbaarheid
Wanneer het proces voltooid is en de oplossing correct is voorbereid, moet deze worden opgeslagen bij -20°C. Peptiden die cysteïne, methionine of tryptofaan bevatten, moeten worden opgeslagen in een zuurstofvrije omgeving om oxidatieve schade te voorkomen. Peptideoplosbaarheid
Disclaimer
De genoemde producten zijn niet bedoeld voor menselijke of dierlijke consumptie. Research chemicaliën zijn uitsluitend bedoeld voor laboratoriumonderzoek en/of in-vitro testen. Iedere vorm van lichamelijke toediening is strikt verboden volgens de wet. Alle aankopen zijn uitsluitend beperkt tot erkende onderzoekers en/of gekwalificeerde professionals. Alle informatie gedeeld in dit artikel is uitsluitend bedoeld voor educatieve doeleinden. Peptideoplosbaarheid
Referenties
Chipens, G. I., Balodis, I.uI.u, & Gnilomedova, L. E. (1991). Polarity and hydropathic properties of natural amino acids. Beschikbaar via: Aminozuur Polariteit Studie
Sikora, K., Jaśkiewicz, M., Neubauer, D., Migoń, D., & Kamysz, W. (2020). The Role of Counter-Ions in Peptides-An Overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442. DOI: Counter-Ions in Peptides Studie
Jameel, F., Alexeenko, A., Bhambhani, A., et al. (2021). Recommended Best Practices for Lyophilization Validation-2021 Part I. AAPS PharmSciTech, 22(7), 221. DOI: Lyophilization Best Practices
Shaw, K. L., Grimsley, G. R., Yakovlev, G. I., Makarov, A. A., & Pace, C. N. (2001). The effect of net charge on the solubility, activity, and stability of ribonuclease Sa. Protein Science, 10(6), 1206–1215. DOI: Net Charge and Solubility Studie
Savige, W. E., & Fontana, A. (1980). Oxidation of tryptophan to oxindolylalanine by dimethyl sulfoxide-hydrochloric acid. International Journal of Peptide and Protein Research, 15(3), 285–297. DOI: DMSO Oxidation Studie
Dr. Usman
Dr. Usman (BSc, MBBS, MaRCP) voltooide zijn studie geneeskunde aan het Royal College of Physicians in Londen. Hij is een toegewijd onderzoeker met meer dan 30 publicaties in internationaal erkende peer-reviewed tijdschriften. Dr. Usman heeft gewerkt als onderzoeker en medisch consultant voor gerenommeerde farmaceutische bedrijven zoals Johnson & Johnson en Sanofi.